Dit is de meest gebruikte methode van sterilisatie. In tegenstelling tot warme droge lucht, die kiemen doodt door onttrekken van water en oxidatie, zorgt stoom voor een denaturatie van essentiële proteïnen, en dit aan lagere temperatuur en een kortere expositietijd vergeleken met droge lucht (Stoomsterilisatie: 15 min aan 121 °C en 2 atmosfeer druk; Warme luchtsterilisatie: 30 min aan 180 °C). Hoe hoger de temperatuur en de druk des te sneller gebeurt de sterilisatie. Een voorwaarde voor effectieve stoomsterilisatie is wel dat het materiaal vlot toegankelijk moet zijn voor de stoom. Daarom moet correct worden gestapeld in de autoclaaf: niet te dicht bij elkaar en nauwsluitende trommels of dozen moeten worden voorzien van openingen waardoor de stoom kan penetreren. Er zijn tal van autoclaven: van eenvoudige, kleine en goedkope tot zeer grote, volledig automatische toch zeer dure toestellen. De correcte combinatie van sterilisatietijd, temperatuur en druk zijn afhankelijk van het type autoclaaf en van het materiaal dat worden gesteriliseerd. De verpakking van het te steriliseren materiaal moet doorgankelijk zijn voor stoom maar niet voor bacteriën. Om de efficiëntie van autoclaven te controleren is het steeds aangewezen een “indicator” te gebruiken. Meestal wordt gebruik gemaakt van chemische indicatoren (klevers) die van kleur veranderen van zodra de correcte temperatuur bereikt is. Daarnaast zijn er ook biologische indicatoren (o.a. bacteriële sporen) die men na het autoklaveren een tijdje moet incuberen en bij (effectieve sterilisatie) geen groei mogen vertonen. Let wel: een indicator aangebracht op de buitenzijde van de verpakking zegt in principe niets over de steriliteit van zijn inhoud. Het is eveneens belangrijk alle gesteriliseerde verpakkingen te dateren. De houdbaarheid van gesteriliseerd materiaal is sterk afhankelijk van de manier waarop het verpakt is en bewaard wordt. Stoomsterilisatie wordt vooral toegepast voor instrumenten, verbandmateriaal, watten, operatiedoeken, katheders, sonden en vloeistof oplossingen. Bij het autoklaveren mag rubber niet in contact komen met metaal omdat het eraan vastkleeft. Bij herhaaldelijk autoklaveren worden scherpere instrumenten bot.